课时2　赋予生物新的遗传特性的基因工程

重点1　基因工程和蛋白质工程

【知识盘查】

1.归纳基因工程的基本工具

提醒　若用不同的限制酶切割出不同的黏性末端，则能使目的基因和载体定向连接，避免自身环化和反向连接，提高连接的有效性。

2.理解掌握基因工程的操作步骤

(1)目的基因的筛选与获取

(2)基因表达载体的构建——重组质粒的构建

提醒　①启动子和终止子：启动子(DNA片段)≠起始密码子(位于mRNA上)；终止子(DNA片段)≠终止密码子(位于mRNA)上。

②目的基因插入位置：启动子与终止子之间。

③利用乳腺生物反应器生产药物时，应将目的基因与乳腺中特异表达的基因的启动子等调控元件重组在一起。

(3)将目的基因导入受体细胞

(4)目的基因的检测与鉴定

提醒　PCR技术不仅可用于获取和扩增目的基因，还能用于检测受体细胞中是否含有目的基因或受体细胞中的目的基因是否转录出mRNA。

3.图示法解读蛋白质工程

【曾经这样考】

1.(2023·新课标卷，6)某同学拟用限制酶(酶1、酶2、酶3和酶4)、DNA连接酶为工具，将目的基因(两端含相应限制酶的识别序列和切割位点)和质粒进行切割、连接，以构建重组表达载体。限制酶的切割位点如图所示。

下列重组表达载体构建方案合理且效率最高的是(　　)

A.质粒和目的基因都用酶3切割，用E.coli DNA连接酶连接

B.质粒用酶3切割、目的基因用酶1切割，用T4 DNA连接酶连接

C.质粒和目的基因都用酶1和酶2切割，用T4 DNA连接酶连接

D.质粒和目的基因都用酶2和酶4切割，用E.coliDNA连接酶连接

答案　C

解析　酶3切割后得到的是平末端，应该用T4 DNA连接酶连接，A不符合题意；质粒用酶3切割后得到平末端，目的基因用酶1切割后得到的是黏性末端，二者不能连接，B不符合题意；质粒和目的基因都用酶1和酶2切割后得到黏性末端，用T4 DNA连接酶连接，还能保证目的基因在质粒上的连接方向，此重组表达载体的构建方案最合理且高效，C符合题意；若用酶2和酶4切割质粒和目的基因，会破坏质粒上的抗生素抗性基因，连接形成的基因表达载体缺少标记基因，无法进行后续的筛选，D不符合题意。

2.(2024·江西卷，12)γ－氨基丁酸在医药等领域有重要的应用价值。利用L－谷氨酸脱羧酶(GadB)催化L－谷氨酸脱羧是高效生产γ－氨基丁酸的重要途径之一。研究人员采用如下图方法将酿酒酵母S的L－谷氨酸脱羧酶基因(gadB)导入生产菌株E.coliA，构建了以L－谷氨酸钠为底物高效生产γ－氨基丁酸的菌株E.coliB。下列叙述正确的是(　　)

A.图中表明，可以从酿酒酵母S中分离得到目的基因gadB

B.E.coliB发酵生产γ－氨基丁酸时，L－谷氨酸钠的作用是供能

C.E.coliA和E.coliB都能高效降解γ－氨基丁酸

D.可以用其他酶替代NcoⅠ和KpnⅠ构建重组质粒

答案　A

解析　分析题意，可以从酿酒酵母S中筛选、分离出目的基因gadB，然后利用PCR扩增目的基因，A正确；由题意知，L－谷氨酸钠是生产γ－氨基丁酸的底物，不能用来供能，B错误；将目的基因(gadB)导入菌株E.coliA构建高效生产

γ－氨基丁酸的菌株E.coliB，E.coliA和E.coliB均不能高效降解γ－氨基丁酸，C错误；根据题干提供的信息，无法推断出是否有其他酶能够替代NcoⅠ和KpnⅠ，D错误。

3.(2023·重庆卷，12)某小组通过PCR(假设引物长度为8个碱基，短于实际长度)获得了含有目的基因的DNA片段，并用限制酶进行酶切(如下图)，再用所得片段成功构建了基因表达载体。下列叙述错误的是(　　)

A.实验所用引物，其中一个序列为5′－TGCGCAGT－3′

B.步骤①所用酶是SpeⅠ和CfoⅠ

C.用步骤①的酶对载体进行酶切至少获得了2个片段

D.酶切片段和载体连接时可使用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶

答案　B

解析　根据扩增所得DNA片段可知，实验所用的两种引物序列为5′－TGCGCAGT－3′和5′－AGCTAGCA－3′，A正确；根据酶切后得到的黏性末端判断，步骤①所用酶是NheⅠ和CfoⅠ，B错误；步骤①用两种酶切割载体(质粒)，质粒上至少有两个切口，至少产生2个片段，C正确；目的基因片段和质粒经酶切后产生的均为黏性末端，可用E.coli DNA连接酶或T4 DNA连接酶连接，D正确。

4.(2024·新课标卷，35)某研究小组将纤维素酶基因(N)插入某种细菌(B1)的基因组中，构建高效降解纤维素的菌株(B2)。该小组在含有N基因的质粒中插入B1基因组的M1与M2片段；再经限制酶切割获得含N基因的片段甲，片段甲两端分别为M1与M2；利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术将片段甲插入B1的基因组，得到菌株B2。酶切位点(Ⅰ～Ⅳ)、引物(P1～P4)的结合位置、片段甲替换区如下图所示，→表示引物5′→3′方向。回答下列问题。

(1)限制酶切割的化学键是________。为保证N基因能在菌株B2中表达，在构建片段甲时，应将M1与M2片段分别插入质粒的Ⅰ和Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ酶切位点之间，原因是_____________________________________________________________

___________________________________________________________________。

(2)CRISPR/Cas9技术可以切割细菌B1基因组中与向导RNA结合的DNA。向导RNA与B1基因组DNA互补配对可以形成的碱基对有G—C和____________________。

(3)用引物P1和P2进行PCR可验证片段甲插入了细菌B1基因组，所用的模板是____________；若用该模板与引物P3和P4进行PCR，实验结果是___________________________________________________________________。

(4)与秸秆焚烧相比，利用高效降解纤维素的细菌处理秸秆的优点是___________________________________________________________________

__________________________________________________(答出2点即可)。

答案　(1)磷酸二酯键　保证N基因启动子、N基因、N基因终止子的完整性，确保N基因能够顺利表达

(2)C—G、U—A、A—T

(3)菌株B2的基因组　无PCR产物

(4)无空气污染；更安全，无火灾隐患；分解效率更高，高效利用秸秆资源等

解析　(1)限制酶作用于DNA的磷酸二酯键。由题述可知，该过程是将重组质粒特定位点，接入M1、M2，再利用限制酶切出新的片段甲替换区(M1＋启动子＋N基因＋终止子＋M2)，再接入B1基因组中，得到B2，因此在M1和M2之间，需要保证N基因完整性，同时需要保证N基因能够正常表达，因此需要把M1接入启动子之前，M2接入终止子之后。(2)根据所给信息，向导RNA需要与对

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